ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Работа 1. Определение бензола, нитробензола и бензонитрила в их смесях
При пропускании через колонку с полярным сорбентом силикагелем раствора, содержащего бензол, нитробензол и бензонитрил, различающихся полярностью, в случае использования в качестве элюента гексана в первую очередь вымывается бензол, затем более полярные нитробензол и бензонитрил.
Количественное определение одно или всех компонентов смеси проводят методом абсолютной калибровки.
Приборы и реактивы
Жидкостной хроматограф «Цвет-304» с УФ-детектором.
Колонка длиной 100 мм, с внутренним диаметром 4 мм, заполненная силикагелем марки С-3, диаметр частиц 5 – 10 мкм.
Микрошприц вместимостью 10 мкл.
Микробюретка вместимостью 1 мкл.
Секундомер.
Подвижный растворитель (элюент) – гексан.
Растворы бензола, нитробензола, бензонитрила в гексане с содержанием (соответственно) 10, 0,06 и 0,2 мг/мл.
Анализируемый раствор: смесь 2% бензола, 0,01% нитробензола и 0,05% бензонитрила в растворе ССl4.
Скорость диаграммной ленты 240 или 720 мм/ч.
Выполнение работы.
Перед включением прибора необходимо внимательно прочитать инструкцию по эксплуатации прибора!
Включают прибор, устанавливают расход элюента, равный 1,2 мл/мин, с помощью микробюретки, переключатель «множитель шкалы» устанавливают в положении «40». Вводят в дозатор 1 мкл смеси, на хроматограмме получают четыре пика: первый пик – неудержимое вещество (тетрахлорид углерода), затем последовательно – бензол, нитробензол и бензонитрил. Измеряют секундомером время выхода каждого компонента t (в с). Анализ повторяют 3 раза.
Расчет содержания компонента в смеси проводят методом абсолютной калибровки. При тех же условиях хроматографируют поочередно 1, 2, 3 и 4 мкл раствора нитробензола. Строят график h = f(снб) и находят содержание нитробензола gнб в смеси, взяв высоту пика h как среднее их трех измерений.
Аналогично рассчитывают содержание бензола gбен в смеси, предварительно хроматографируя раствор бензола.
Результаты заносят в таблицу.
|
Компонент смеси |
t1 |
t2 |
t3 |
tcp |
h1 |
h2 |
h3 |
hcp |
|
Неудерживаемое вещество Бензол Нитробензол Бензонитрил |
|
|
|
|
|
|
|
|
Пользуясь хроматограммой анализируемой смеси, рассчитывают хроматографические параметры tR’, VR’, k’, R, N и Н.
|
Компонент смеси |
tR |
V’R |
k’ |
R |
N |
H |
g мг/мл |
|
Неудерживаемое вещество Бензол Нитробензол Бензонитрил |
|
|
|
|
|
|
|
Хроматограммы и градуировочные графики приклеивают в лабораторный журнал.
Работа 2. Определение о-, м-, п-нитрофенолов в их смеси
Высокоэффективная жидкостная хроматография в нормальном фазовом варианте (полярный сорбент – неполярный элюент) рекомендуется для разделения изомеров. Изомеры имеют различное время удерживания на силикагеле благодаря разному расположению полярных групп. Идентификацию пиков на хроматограмме проводят методом добавок индивидуальных изомеров. Количественное определение одного из изомеров проводит методом абсолютной калибровки.
Приборы и реактивы
Жидкостной хроматограф «Цвет-304» с УФ-детектором.
Колонка длиной 100 мм, с внутренним диаметром 4 мм, заполненная силикагелем марки С-3, диаметр частиц 5 – 10 мкм.
Микрошприц вместимостью 10 мкл.
Микробюретка для определения расхода элюента.
Секундомер.
Подвижный растворитель: 4%-ный раствор изопропилового спирта в гексане.
Растворы о-, м-, п-нитрофенолов (по 0,1%).
Смесь изомеров: неизвестного состава в изопропиловом спирте в гексане.
Скорость диаграммной ленты самописца 720 мм/ч.
Выполнение работы.
Включают прибор согласно инструкции. Работу проводят при комнатной температуре. Переключатель «множитель шкалы» устанавливают в положение «40», расход элюента устанавливают 1,2 мл/мин, контролируя на выходе из капилляра детектора микробюреткой. Вводят в дозатор 2 мкл смеси, не закрывая кран дозатора, вводят 2 мкл тетрахлорида углерода в качестве неудерживаемого вещества. Измеряют секундомером время выхода каждого компонента. Анализ повторяют три раза. Если необходимо, переключать «множитель шкалы» так, чтобы высота пика составляла 50% от шкалы КСП.
На хроматограмме получают 4 пика. Чтобы идентифицировать пики изомеров нитрофенола, применяют метод добавок. Для этого в дозатор вводят 2 мкл смеси в 1 мкл раствора одного из изомеров и хроматографируют при тех же условиях. Высота одного пика увеличивается (может зашкалить). Затем повторяют хроматографирование смеси с добавлением раствора другого изомера и т.д.
Идентифицируют пики о-, м-, п-изомеров нитрофенола, объясняют порядок выхода изомеров, рассчитывают времена удерживания, площади пиков и заносят результаты в таблицу:
|
Компонент смеси |
tR |
S |
|||||||
|
t1 |
t2 |
t3 |
tRcp |
t’R |
s1 |
s2 |
s3 |
scp |
|
|
Неудерживаемое вещество о-нитрофенол м-нитрофенол п-нитрофенол |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Содержание одного (или всех) изомеров рассчитывают методом абсолютной калибровки. Хроматографируют поочередно 1, 2, 3 и 4 мкл раствора каждого изомера. Добиваются воспроизведения результатов для каждой пробы (не менее 3 раз). Строят градуировочные графики S = f(cизб) и определяют содержимое изомеров в смеси g (в мкг/мкл или мг/мл). Рассчитывают объемы удерживания, зная tR’ и скорость элюента, k’, N, H, R, a [относительно о-нитрофенола по уравнениям (3.3) – (3.5); (3.7); (3.16)].
Хроматограммы и графики приклеивают в лабораторный журнал:
|
Компонент |
V’Rcp |
k’ |
a |
R |
N |
H |
g, мкг/мкл |
|
Неудерживаемое вещество о-нитрофенол м-нитрофенол п-нитрофенол |
|
|
|
|
|
|
|